Analiza trasorilor fluorescenţi 

Institutul de Speologie "Emil Racoviţă" are o lungă tradiţie şi a acumulat o bogată experienţă în realizarea de lucrări de marcare a apei subterane. Acestea au ca principal scop determinarea traseului parcurs de apă, dar pot conduce şi la aprecieri privind natura şi configuraţia reţelei subterane sau la estimarea volumului de apă cantonat în acvifer.

Multe substanţe organice prezintă proprietatea de a fi fluorescente în mod natural (intrinsec fluorescente) sau de a deveni fluorescente în momentul în care sunt iradiate cu o sursă de lumină, de regulă în domeniul ultraviolet. În experimentele de marcare a apei subterane se folosesc în mod curent compuşi organici de sinteză cum sunt: eosina, sulforodamina B, rodamina WT, amidorodamina G, etc. De notorietate sunt însă fluoresceina şi rodamina B. Ambele aceste substanţe se pretează la determinări analitice cantitative. Din punct de vedere chimic, atât fluoresceina, cât şi rodamina B sunt acizi organici. În mod obişnuit, pentru lucrările de marcare cu fluoresceină se foloseşte sarea de sodiu a acesteia, denumită şi uranină, care este mult mai solubilă în apă.

Metodele de dozare catitativă a fluoresceinei şi rodaminei din probe de apă se bazează pe faptul că intesitatea emisiei de fluorescenţă este proporţională cu concentraţia substanţelor respective în apă. Această proporţionalitate se păstrează pe domenii limitate şi de regulă joase de concentraţie. Atât limitele de detecţie, cât şi sensibilităţile de analiză sunt în mod nemijlocit legate de performanţele instrumentului de măsură utilizat. Acesta poate fi un fluorimetru sau un spectrofluorimetru. Primul are o configuraţie constructivă mai simplă, dar şi posibilităţi de lucru limitate. 

Schema constructivă de principiu a unui spectrofluorimetru este redată în diagrama alăturată. În construcţia sa intră o sursă de lumină de înaltă intensitate, care are rolul de a bombarda proba cu fotoni în scopul trecerii în stare de excitare a unui numar cât mai mare de moleculele organice existente în probă, într-un un anumit interval de timp. Radiaţia emisă de sursă trebuie să fie monocromată, la lungimea de undă specifică excitării substanţei de analizat înainte ca aceasta să ajungă la cuva în care se află proba, lucru ce se realizează cu un prim monocromator.

Radiaţia de fluorescenţă este emisă de probă în toate direcţiile, dar este indicată colectarea sa de un al doilea monocromator poziţionat la un unghi de 90° faţă de direcţia radiaţiei de excitare, după care este transformată în semnal analogic sau digital de către un fotodetector. Această geometria este preferată în scopul minimalizării interferenţelor suferite de detector din partea luminii de excitaţie transmise.  Lungimile de undă de excitare şi emisie sunt în cazul fluoresceinei de 491 şi respectiv 512 nm, la probe tamponate la pH 8.0. Pentru rodamina B lungimea de undă la care se face excitare este 555 nm, iar maximul de emisie este la 580 nm.

Laboratorul de Hidrogeochimie are în dotare unul din cele mai performante modele de spectrofluorimetre existente în momentul de faţă. Respectiv, modelul LS-45 produs de PerkinElmer (Massachusetts, USA). Instrumentul are ca sursă de radiaţie o lampă de xenon cu pulsuri de 8,3 Watt, două monocromatoare Monk-Gillieson cu reţele holografice şi fotomultiplicator mono-canal (PMT) standard. Domeniul spectral pentru emisie este 200–900 nm, iar pentru excitaţie 200–800 nm. Acurateţea lungimii de undă este de 1 nm, cu o reproductibilitate de 0,5 nm. Fantele, atât pentru emisie, cât şi pentru excitaţie sunt fixe, cu valoarea de 10 nm.

Monocromatoarele fiind cu reţele de difracţie transmit lumina la o lungime de undă reglabilă şi cu o toleranţă ajustabilă. Adică, fascicolul luminos colimat atinge reţeaua de difracţie şi iese sub un unghi diferit în funcţie de lngimea de undă dorită. Aparatul fiind dotat o sursă continuă de lumină pentru excitaţie şi două monocromatoare există posibilitatea înregistrării simultane atât a spectrului de excitaţie, cât şi cel de fluorescenţă. Viteza de scanare poate fi variată între 10 şi 1500 nm/minut, cu un pas de cel puţin 1 nm.

Exemplu de scanare a spectrelor de excitare şi emisie realizate cu spectrofluorimetrul LS-45 PerkinElmer pe o soluţie de fluoresceină în apă distilată având concentraţia de 0,25 µg/L. Linia albastră reprezintă spectrul de excitaţie, iar linia roşie spectrul de fluorescenţă. Pe abscisă sunt înscrise lungimile de undă, iar pe ordonată sunt intensităţile.