Analiza trasorilor fluorescenţi
Institutul de Speologie "Emil Racoviţă" are o lungă tradiÅ£ie ÅŸi a acumulat o bogată experienţă în realizarea de lucrări de marcare a apei subterane. Acestea au ca principal scop determinarea traseului parcurs de apă, dar pot conduce ÅŸi la aprecieri privind natura ÅŸi configuraÅ£ia reÅ£elei subterane sau la estimarea volumului de apă cantonat în acvifer.
Multe substanÅ£e organice prezintă proprietatea de a fi fluorescente în mod natural (intrinsec fluorescente) sau de a deveni fluorescente în momentul în care sunt iradiate cu o sursă de lumină, de regulă în domeniul ultraviolet. În experimentele de marcare a apei subterane se folosesc în mod curent compuÅŸi organici de sinteză cum sunt: eosina, sulforodamina B, rodamina WT, amidorodamina G, etc. De notorietate sunt însă fluoresceina ÅŸi rodamina B. Ambele aceste substanÅ£e se pretează la determinări analitice cantitative. Din punct de vedere chimic, atât fluoresceina, cât ÅŸi rodamina B sunt acizi organici. În mod obiÅŸnuit, pentru lucrările de marcare cu fluoresceină se foloseÅŸte sarea de sodiu a acesteia, denumită ÅŸi uranină, care este mult mai solubilă în apă.
Metodele de dozare catitativă a fluoresceinei ÅŸi rodaminei din probe de apă se bazează pe faptul că intesitatea emisiei de fluorescenţă este proporÅ£ională cu concentraÅ£ia substanÅ£elor respective în apă. Această proporÅ£ionalitate se păstrează pe domenii limitate ÅŸi de regulă joase de concentraÅ£ie. Atât limitele de detecÅ£ie, cât ÅŸi sensibilităţile de analiză sunt în mod nemijlocit legate de performanÅ£ele instrumentului de măsură utilizat. Acesta poate fi un fluorimetru sau un spectrofluorimetru. Primul are o configuraÅ£ie constructivă mai simplă, dar ÅŸi posibilităţi de lucru limitate.
Schema constructivă de principiu a unui spectrofluorimetru este redată în diagrama alăturată. În construcÅ£ia sa intră o sursă de lumină de înaltă intensitate, care are rolul de a bombarda proba cu fotoni în scopul trecerii în stare de excitare a unui numar cât mai mare de moleculele organice existente în probă, într-un un anumit interval de timp. RadiaÅ£ia emisă de sursă trebuie să fie monocromată, la lungimea de undă specifică excitării substanÅ£ei de analizat înainte ca aceasta să ajungă la cuva în care se află proba, lucru ce se realizează cu un prim monocromator.
RadiaÅ£ia de fluorescenţă este emisă de probă în toate direcÅ£iile, dar este indicată colectarea sa de un al doilea monocromator poziÅ£ionat la un unghi de 90° faţă de direcÅ£ia radiaÅ£iei de excitare, după care este transformată în semnal analogic sau digital de către un fotodetector. Această geometria este preferată în scopul minimalizării interferenÅ£elor suferite de detector din partea luminii de excitaÅ£ie transmise. Lungimile de undă de excitare ÅŸi emisie sunt în cazul fluoresceinei de 491 ÅŸi respectiv 512 nm, la probe tamponate la pH 8.0. Pentru rodamina B lungimea de undă la care se face excitare este 555 nm, iar maximul de emisie este la 580 nm.
Laboratorul de Hidrogeochimie are în dotare unul din cele mai performante modele de spectrofluorimetre existente în momentul de faţă. Respectiv, modelul LS-45 produs de PerkinElmer (Massachusetts, USA). Instrumentul are ca sursă de radiaÅ£ie o lampă de xenon cu pulsuri de 8,3 Watt, două monocromatoare Monk-Gillieson cu reÅ£ele holografice ÅŸi fotomultiplicator mono-canal (PMT) standard. Domeniul spectral pentru emisie este 200–900 nm, iar pentru excitaÅ£ie 200–800 nm. AcurateÅ£ea lungimii de undă este de 1 nm, cu o reproductibilitate de 0,5 nm. Fantele, atât pentru emisie, cât ÅŸi pentru excitaÅ£ie sunt fixe, cu valoarea de 10 nm.
Monocromatoarele fiind cu reÅ£ele de difracÅ£ie transmit lumina la o lungime de undă reglabilă ÅŸi cu o toleranţă ajustabilă. Adică, fascicolul luminos colimat atinge reÅ£eaua de difracÅ£ie ÅŸi iese sub un unghi diferit în funcÅ£ie de lngimea de undă dorită. Aparatul fiind dotat o sursă continuă de lumină pentru excitaÅ£ie ÅŸi două monocromatoare există posibilitatea înregistrării simultane atât a spectrului de excitaÅ£ie, cât ÅŸi cel de fluorescenţă. Viteza de scanare poate fi variată între 10 ÅŸi 1500 nm/minut, cu un pas de cel puÅ£in 1 nm.
Exemplu de scanare a spectrelor de excitare ÅŸi emisie realizate cu spectrofluorimetrul LS-45 PerkinElmer pe o soluÅ£ie de fluoresceină în apă distilată având concentraÅ£ia de 0,25 µg/L. Linia albastră reprezintă spectrul de excitaÅ£ie, iar linia roÅŸie spectrul de fluorescenţă. Pe abscisă sunt înscrise lungimile de undă, iar pe ordonată sunt intensităţile.